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cDNA是什麼意思?CDNA與DNA有何區別?

cDNA是什麼意思?

cDNA(全稱complementary DNA)是一種互補的單鏈脫氧核糖核酸。它與mRNA鏈互補,在適當的引物存在下,由mRNA與DNA進行一定條件下的合成,形成單鏈DNA,就是cDNA。

cDNA與mRNA是相同還是互補的序列?

cDNA是一種雙鏈DNA分子,由兩條互補的鏈組成。其中,cDNA的第一條鏈與mRNA互補,而另一條鏈與mRNA相同。

CDNA與基因組DNA有何區別?

一、來源不同

cDNA:cDNA是由mRNA為模板,在適當的引物存在下,通過反轉錄過程得到的DNA,是與mRNA鏈互補的單鏈DNA。

基因組DNA:基因組DNA是指一個生物體的全部基因組成的DNA序列,控制著該生物體的生命過程和遺傳訊息。

二、所屬細胞類型不同

cDNA:cDNA的基因可以來自於原核細胞或真核細胞。

基因組DNA:基因組DNA屬於真核細胞,是真核生物的遺傳物質。

三、結構不同

cDNA:cDNA內部不包含內含子等結構,只包含外顯子序列。

基因組DNA:基因組DNA通常包含內含子等結構,包括編碼區和非編碼區。

cdna可以在4度保存多久?

一般情況下,樣品可以保存一個月。在實驗室中,通常會在4℃或-30℃的冰箱中保存樣品。如果你想要長時間保存並且暫時用不到,最好將樣品放在低溫的冰箱中。

cdna在-20沒有被凍住?

RNA沒有被凍住是因為它會降解。將RNA溶於dd水中是最好的方法,DEPC可以加速降解過程。剛提取的RNA應該在檢測之後迅速進行反轉錄,然後將cDNA在-20℃保存。但是對於反轉錄來說,即使RNA在-20℃保存幾個星期也不會有太大的影響。降解率不僅取決於最初溶解RNA的水,還取決於儲存條件和時間。

cDNA文庫與基因組文庫有什麼不同?

針對真核生物,基因組文庫包含了該生物體內的所有基因,包括外顯子、內含子和非編碼區。而cDNA文庫只包含了部分基因,因為cDNA文庫來源於該生物體內的mRNA的逆轉錄,而mRNA來源於外顯子的轉錄,不包括內含子和非編碼區。

而對於原核生物,基因組文庫包含了該生物體內的所有基因,包括編碼區和非編碼區。而cDNA文庫只包含了部分基因,因為cDNA文庫來源於該生物體內的mRNA的逆轉錄,而mRNA來源於編碼區的轉錄,不包括非編碼區。

cDNA文庫必須滿足什麼條件其構建包括哪些步驟?

(1) mRNA的製備:通常mRNA只佔總RNA的1%-5%,因此應選擇目的基因在細胞或組織中表達最豐富的來源作為材料,例如要獲取胰島素基因,應以胰島β細胞為原始生物材料,而要獲取細胞因子基因,則應選擇經抗原或絲裂原刺激培養的淋巴細胞。提取總RNA後,可以通過在寡聚脫氧核苷酸(oligo(dT))纖維素中進行親和層析的方式來分離純化mRNA。

(2) cDNA第一鏈的合成:所有cDNA第一鏈的合成方法都需要使用依賴於RNA的DNA聚合酶(反轉錄酶)來催化反應。最常用的引物是與真核細胞mRNA分子3′端poly(A)互補的1218個核苷酸長的oligo(dT),該引物沿著mRNA模板的3′→5′方向進行合成,從不同的結合點合成全長cDNA第一鏈(RNA-DNA)。然而,對於較長的mRNA分子,很難得到全長cDNA。

(3) cDNA第二鏈的合成:通常有自身引導合成法和置換合成法兩種方法。在自身引導合成法中,首先用鹼處理mRNA-cDNA雜交體,水解mRNA模板,cDNA第一鏈的3′端能夠形成髮夾結構,這種結構可用作合成cDNA第二鏈的引物。接著,在大腸桿菌DNA聚合酶Klenow片段或反轉錄酶的作用下,以四種dNTP為原料完成雙鏈cDNA的合成,然後在其末端相應於mRNA 5′端的位置藉助髮夾結構閉合成環,再用單鏈特異性的S1核酸酶消化此環,得到雙鏈cDNA分子,可以通過適當的方法克隆到載體中。在置換合成法中,利用RNA酶H和DNA聚合酶I共同催化切口平移反應來合成cDNA第二鏈,其中RNA酶H在mRNA-cDNA雜交體中的mRNA鏈上造成切口或缺口,而E. coli DNA聚合酶I以RNA片段為引物,合成DNA鏈,取代模板上的mRNA。這些DNA片段經T4噬菌體DNA連接酶連接,形成完整的cDNA第二鏈。置換合成法最大的優點是可以獲得接近全長的雙鏈cDNA產物,並具有無須處理和純化以及高效率的特點。

(4) cDNA與載體連接和導入宿主細胞:cDNA片段與載體DNA的連接是指在一定的條件下,通過DNA連接酶催化兩個雙鏈DNA片段相鄰的5′-P與3′-OH之間形成磷酸二酯鍵的過程。由於T4 DNA連接酶具有廣泛的底物範圍,尤其是能夠有效連接DNA的平末端,因此被廣泛應用於連接cDNA和載體DNA。連接後,通過適當的方法將靶DNA導入受體細胞,使其進行大量複製、增殖和表達,從而獲得大量的克隆基因。

cDNA文庫是什麼?

cDNA是逆轉錄酶以mRNA為模板催化形成的互補DNA(cDNA),其核苷酸序列與模板mRNA鏈完全互補。然後,以cDNA為模板,由DNA聚合酶合成第二鏈,得到互補雙鏈DNA。由於模板mRNA含有該種細胞的各種mRNA分子,因此合成的cDNA產物是各種mRNA拷貝的混合物。接著,將雙鏈產物與載體(如質粒或噬菌體)DNA重組,然後轉化到宿主細菌或包裝成噬菌體顆粒,從而得到一系列重組的克隆混合體。每個克隆包含單獨一種mRNA分子,所有克隆的總和包含細胞的全部mRNA訊息,即cDNA文庫。

cdna文庫的構建所用的酶有哪些?

反轉錄酶:通過以mRNA為模板的反轉錄過程合成DNA。

限制性內切酶:酶切目的基因和載體,使它們產生相同的粘性末端。

DNA連接酶:將目的基因和載體連接起來。

cDNA是雙鏈嗎?

你知道在real-time PCR中使用cDNA和DNA的目的有什麼不同嗎?使用DNA通常是為了檢測基因組中目標片段的數量,而使用cDNA通常是為了檢測目標基因的表達量,這當然需要檢測mRNA的量,但是RNA太容易被分解,很難檢測,因此需要使用反轉錄所產生的cDNA。一般反轉錄產生的cDNA是單鏈的,需要其他步驟來形成雙鏈,例如兩步法中的PCR步驟。

cDNA能存放多久?

cDNA可以保存半年,甚至更久,當然更佳的保存方式是在-80度保存。驗證cDNA是否已經降解的最佳方法是通過運行內參基因的PCR實驗。如果實驗結果出現了PCR條帶,那麼就說明該cDNA沒有發生降解。

在分子生物學實驗中,通常使用瓊脂糖凝膠進行核酸電泳分析。如果需要分析100bp大小的核酸片段,則建議使用1.8%的瓊脂糖凝膠。

更換dNTP mix通常不會對實驗結果產生太大的影響。

mRNA長度怎麼比cDNA短?

cDNA和CDS不是同一個概念。CDS代表編碼序列,即由mRNA翻譯成胺基酸序列的部分。CDS通常比mRNA短,因為它不包括5'非翻譯區、3'終止區和poly(A)尾巴等區域。與之不同的是,cDNA是以mRNA為模板反轉錄而成的DNA分子,與編碼區沒有直接關係。

為什麼cDNA文庫沒有啟動子和終止子?

啟動子和終止子是用於控制RNA轉錄的DNA序列,但它們本身並不屬於RNA的序列,因此不會出現在cDNA文庫中,無論它們是否在編碼區。

為了建立cDNA文庫,我們需要使用mRNA作為模板,在反轉錄酶的作用下,在體外將其轉錄成cDNA,並將其連接到適當的載體上(常用的載體包括噬菌體和質粒載體),然後轉化到受體菌中。在這種情況下,每個細菌都會含有一段cDNA,並且可以進行擴增和繁殖,從而形成一個包含細胞所有mRNA訊息的cDNA克隆集合。

什麼是cccDNA?

B型肝炎病毒(HBV)的共價閉合循環狀DNA(cccDNA)是B型肝炎病毒前基因組RNA複製的原始合成模板。

如何獲得cDNA?需要哪些步驟?

通過親和層析法純化的 mRNA 分子通常帶有 3' 端的 poly (A) 尾結構。使用長度為 12-20 個核苷酸的 oligo ( dT )與純化的 mRNA 混合, oligo ( dT )會與 poly (A) 結合,作為反轉錄酶的引物,從而合成 RNA-DNA 的雜交體。在將 cDNA 克隆到載體之前,必須將 RNA 轉變成 DNA 鏈,形成雙鏈 DNA 分子。

由於 cDNA 第一鏈的 3' 末端通常會形成髮夾環結構,這種結構是反轉錄酶在複製第一鏈時「返折」形成的。通過這種方法合成的雙鏈 cDNA 在一端有髮夾環,可以使用單鏈特異的 S1 核酸酶將其切除。切口存在於新合成的 DNA 中,使用 DNA 連接酶將這些切口連接在一起形成一條完整的 DNA 鏈。使用 RNase H 法可以獲得更長的 cDNA 分子,該方法優於 S1 核酸酶法,因為它可以獲得包括 mRNA 5' 端全部或絕大部分的順序 cDNA 分子。

影響影響cdna文庫的完整性的因素?

cDNA文庫合成的影響因素之一是熱穩定性。提高反轉錄過程中的溫度有助於高GC含量或二級結構複雜的RNA模板的變性,從而促進全長cDNA的合成。


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